מהי תגובת שרשרת פולימראז (pcr)? עובדות על מבחן, שלבים ומשומשים עבור

מהי PCR (תגובת שרשרת פולימראז)?

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא טכניקה המשמשת להגברה של כמויות עקבות של DNA (ובמקרים מסוימים RNA) הנמצאים כמעט או על כל נוזל או משטח שבהם ניתן להפקיד גדילי DNA. המפתח להבנת ה- PCR הוא לדעת שכל אדם, בעל חיים, צמח, טפיל, חיידק או נגיף מכיל חומר גנטי כמו רצפי DNA (או RNA) (רצפי נוקליאוטידים או חתיכות DNA או RNA) שהם ייחודיים למין שלהם, ולחבר הבודד מאותו מין. כתוצאה מכך, אם מדגם מכיל מקטעי DNA או RNA, PCR היא שיטה המשמשת להגברה (ליצור עותקים רבים יותר זהים) של רצפים ייחודיים אלה, כך שניתן יהיה להשתמש בהם כדי לקבוע בסבירות גבוהה מאוד את זהות המקור (א אדם ספציפי, בעל חיים או אורגניזם פתוגני) של ה- DNA העקבות או ה- RNA המצוי כמעט או בכל מדגם של חומר.

הגברת PCR היא רק חלק מהבדיקה המזהה. ברגע שההגברה נעשית (ראה להלן), יש להשוות את הקטעים המוגברים לקטעי נוקלאוטידים אחרים ממקור ידוע (למשל, אדם ספציפי, בעל חיים או אורגניזם פתוגני). השוואה זו של קטעים ייחודיים נעשית לרוב על ידי הצבת רצפי נוקליאוטידים שנוצרו על ידי PCR לצד רצפי נוקלאוטידים ידועים מבני אדם, פתוגנים או מקורות אחרים בג'ל המפריד. זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל ורצפי הנוקלאוטידים השונים יוצרים להקות הדומות ל"סולם "על פי המטען החשמלי שלהם וגודלם המולקולרי. זה נקרא אלקטרופורזה ג'ל. להקות או "סולם" כמו צעדים הנודדים לאותן רמות בג'ל מראים זהות של רצפי נוקליאוטידים. שיטה זו היא אחת הדרכים הפופולריות ביותר להשלמת בדיקות PCR (ראה איור 1).

איור 1, להקות או "סולם" כמו שלבים של PCR המיוצרים DNA של Mycobacterium (באדיבות ה- CDC)

דמות. אלמנט חוזר (Rep) –PCR (A) ותאי אלקטרופורזה בג'ל פולש (PFGE) (B) של מבודדי Mycobacterium cosmeticum משני חולים באוהיו וחולה אחד בוונצואלה. Rep-PCR בוצע באמצעות פריימר BOXA1R (3), ו- PFGE בוצע עם אנזים הגבלה AseI. נתיבים 1, 2, אוהיו מבודד OH1 ו- OH2; נתיבים 3, 4, זני בקרה ATCC BAA-878T ו- ATCC BAA-879; מסלול 5, בידוד ונצואלי VZ1. תקני גודל ה- DNA הם 100-bp (S1) ו- 48.5-kb סמן (S2).

כיצד נעשה PCR (תגובת שרשרת פולימראז)?

בשנת 1983, קרי מוליס מצא את הצעדים הבסיסיים להגברת רצפי ה- DNA. הוא ומייקל סמית 'זכו בפרס נובל על פיתוח הליך זה בשנת 1993. ישנם כמה צעדים בסיסיים אשר נוקטים ברצף; ניתן לבצע PCR בצינור יחיד עם כימיקלים מתאימים ומחמם שתוכנן במיוחד. ריאגנטים או כימיקלים הדרושים הם כדלקמן:

• דגימה המכילה רצף נוקלאוטידים (מדם, שיער, מוגלה, גירוד עור וכו ')
• פריימרים של DNA: DNA קצר חד-גדילי המתחבר לרצפי נוקלאוטידים המקדם סינתזה של גדיל משלים של נוקלאוטידים.
• פולימראזת דנ"א: אנזים שכאשר ל- DNA קשורה פריימר, יורד בקטע ה- DNA המחבר אבני בניין של DNA ליצירת זוגות בסיס משלימים ובכך מסנתז גדיל נוקליאוטיד משלים של DNA (הכנסת פולימראז DNA עמיד בחום, טאק פולימראז, שמקורו בחיידקים עמידים בחום, שיפר באופן ניכר את היכולת לבצע PCR)
• פתרון עודף גדול של אבני בניין של DNA המכונות נוקלאוטידים (אדנין, תמידין, ציטוזין וגואנין, המקוצרים כ- A, T, C ו- G בהתאמה) נמצאים בתמיסה. כאשר חסימות אלה קשורות זו לזו, הן יוצרים רצף נוקליאוטידים או גדיל בודד של DNA. כאשר אבני הבניין הללו קושרות את אבן הבניין המשלימה שלהן על ידי קשרי מימן חלשים (לדוגמא, A יתקשר רק עם T ו- G רק עם C) נוצר רצף DNA משלים של DNA ונקשר ל DNA המקורי החד-גדילי. עם השלמת הכריכה נוצר DNA משולב כפול משלים ברצף ספציפי.

PCR, אם כן, מתחיל בקטע של DNA מדגימה שמונחת בצינור עם המגיבים המפורטים לעיל. התמיסה מחוממת לפחות ל 94 C (201.2 F); חום זה מפרק את קשרי המימן המאפשרים להיווצר גדילי DNA משלימים, כך שרק גדילים בודדים קיימים בתערובת (זה נקרא denaturation של DNA בעל גדיל כפול).

ניתן לתערובת להתקרר לכ -54 צלזיוס. בטמפרטורה זו, הפריימרים של ה- DNA וה- DNA הפולימראז נקשרים ל- DNA יחיד עם חוט גדילים (זה נקרא חישול ה- DNA). מכיוון שאבני הבניין נמצאות בעודף (ריכוז גבוה) בתערובת, הפולימראז משתמש בהן כדי לייצר גדילי DNA משלימים חדשים (המכונים הרחבה של ה- DNA) ותהליך זה מהיר יותר במהירות של 72 צלזיוס (161.6 F). תהליך זה יוצר מולקולת DNA דו-גדילית חדשה מכל אחד מהגדדים הבודדים של המולקולה המקורית.

מחזור זה חוזר על עצמו כ- 40 פעמים במכונה המכונה מחזור תרמי החוזר אוטומטית על מחזורי קירור החימום, כאשר הכמות של כל רצף DNA מכפילה את עצמה בכל סיום מחזור קירור החימום. מה שהיה בתחילה קטע קצר של DNA יכול להיות מוגבר לכ- 100 מיליארד עותקים לאחר 40 מחזורי הכפלה.

מדוע רופא יזמין בדיקת PCR (תגובת שרשרת פולימראז)?

בדיקת ה- PCR מהווה את הבסיס למספר בדיקות שיכולות לענות על שאלות רפואיות רבות ומגוונות שעוזרות לרופאים לאבחן מטופלים ולטפל בהם. לדוגמא, בדיקות PCR יכולות לאתר ולזהות אורגניזמים פתוגניים בקרב חולים, במיוחד כאלה שקשה לטפח (למשל HIV ו- ווירוסים אחרים ופטריות מסוימות).

רופאים אחרים מזמינים בדיקות PCR כדי לסייע באבחון מחלות גנטיות, בעוד שרופאים אחרים משתמשים ב- PCR כדי לאתר קשרים ביולוגיים כמו זיהוי הורים לילדים. בדיקות PCR משמשות גם לזיהוי ואפיון של מוטציות וגידור מחדש של גנים שנמצאים בסוגי סרטן מסוימים.

עם זאת, בדיקות PCR שונו והורחבו להיבטים רבים של חקירות מדעיות, ביניהן ביולוגיה אבולוציונית, טביעת אצבע גנטית, חקירות משפטיות ורבים אחרים.

מה זה RT-PCR?

RT-PCR הוא בדיקת PCR שנועדה לאתר ולמדוד RNA. למרות שבדיקות PCR ראשוניות הגבירו את ה- DNA, נגיפים רבים ורכיבים ביולוגיים אחרים (למשל, מיטוכונדריה) משתמשים ב- RNA כחומר הגנטי שלהם. RT-PCR שונה מה- PCR המקובל על ידי נטילת RNA והמיר את גדיל ה- RNA לחוט DNA. זה נעשה בעצם באותה שיטה עבור PCR שתוארה לעיל, למעט שימוש באנזים המכונה טרנסקריפטאז הפוך במקום פולימראז ה- DNA. הטרנסקריפטאז ההפוך מאפשר לתרגם גדיל יחיד של RNA לשכבת DNA משלימה. ברגע שתגובה זו מתרחשת, ניתן להשתמש בשיטת ה- PCR השגרתית כדי להגביר את ה- DNA. RT-PCR שימש לגילוי וחקר נגיפי RNA רבים.

אין להתבלבל בין RT-PCR לבין וריאציה אחרת של PCR, המכונה PCR בזמן אמת. PCR בזמן אמת הוא וריאציה של PCR המאפשר ניתוח של ה- DNA המוגבר במהלך 40 המחזורים הרגילים של ההליך. אף על פי שהתהליך דומה ל- PCR קונבנציונאלי ברכיבה על אופניים, PCR בזמן אמת משתמש בצבעי ניאון המחוברים לחלק מאבני הבניין או לחוטי נוקלאוטידים קטנים. בהתאם לשיטה בה נעשה שימוש, הקרינה מתרחשת כאשר נוצרים גדילי ה- DNA המוגבר. ניתן למדוד את כמות הקרינה לאורך 40 המחזורים ומאפשרת לחוקרים למדוד מוצרים ספציפיים וכמויותיהם במהלך מחזורי ההגברה. זה בדרך כלל מאפשר לחוקרים או טכנאים במעבדה לדלג על אלקטרופורזה של ג'ל או על נהלים משניים אחרים הדרושים לניתוח מוצרי ה- PCR, וכך להביא לתוצאות מהירות יותר.

PCR בזמן אמת ו- RT-PCR הם וריאציות או שינויים במבחן ה- PCR המקורי. עם זאת, ישנן הרבה יותר וריאציות (לפחות 25) שקיימות ומשמשות לפתרון בעיות ספציפיות. לכולם שמות שונים כמו הרכבה PCR, PCR להתחלה חמה, ריבוי PCR, PCR פאזה מוצקה ורבים אחרים.

ככל הנראה, PCR ימשיך להשתנות כדי לעזור לענות על כל שאלה אחרת ברפואה, בביולוגיה. ותחומי לימוד אחרים.